hír

Az elmúlt évtizedben a génszekvenálási technológiát széles körben alkalmazták a rákkutatásban és a klinikai gyakorlatban, és fontos eszközzé vált a rák molekuláris jellemzőinek feltárásában. A molekuláris diagnosztika és a célzott terápia fejlődése elősegítette a precíziós tumorterápiás koncepciók fejlődését, és nagy változásokat hozott a tumordiagnosztika és -kezelés teljes területén. A genetikai tesztelés felhasználható a rákkockázat előrejelzésére, a kezelési döntések irányítására és a prognózis értékelésére, és fontos eszköz a betegek klinikai eredményeinek javítására. Itt összefoglaljuk a CA Cancer J Clin, a JCO, az Ann Oncol és más folyóiratokban megjelent legújabb cikkeket, amelyek áttekintést nyújtanak a genetikai tesztelés alkalmazásáról a rákdiagnosztikában és -kezelésben.

Szomatikus mutációk és csíravonal-mutációk. Általánosságban elmondható, hogy a rákot olyan DNS-mutációk okozzák, amelyek öröklődhetnek a szülőktől (csíravonal-mutációk) vagy szerezhetők az életkorral (szomatikus mutációk). A csíravonal-mutációk születéstől fogva jelen vannak, és a mutátor általában a test minden sejtjének DNS-ében hordozza a mutációt, és átörökíthető az utódokra. A szomatikus mutációkat az egyének nem ivarsejtes sejtekben szerzik, és általában nem öröklődnek át az utódokra. Mind a csíravonal-, mind a szomatikus mutációk elpusztíthatják a sejtek normális funkcionális aktivitását, és rosszindulatú átalakuláshoz vezethetnek. A szomatikus mutációk a rosszindulatú daganatok egyik fő mozgatórugói és az onkológia legprediktívebb biomarkerei; azonban a daganatos betegek körülbelül 10-20 százaléka hordoz olyan csíravonal-mutációkat, amelyek jelentősen növelik a rák kockázatát, és ezek közül a mutációk közül néhány terápiás is.
Driver mutáció és passenger mutáció. Nem minden DNS-variáns befolyásolja a sejtek működését; átlagosan öt-tíz genomiális eseményre, úgynevezett „driver mutációkra” van szükség a normális sejtdegeneráció kiváltásához. A driver mutációk gyakran a sejtek élettevékenységéhez szorosan kapcsolódó génekben fordulnak elő, például a sejtek növekedésének szabályozásában, a DNS-javításban, a sejtciklus szabályozásában és más életfolyamatokban részt vevő génekben, és terápiás célpontként is felhasználhatók. Azonban bármely rákban a mutációk teljes száma meglehetősen nagy, néhány ezertől egyes emlőrákokban egészen több mint 100 000-ig terjed, egyes erősen variábilis vastagbél- és méhnyálkahártya-rákokban. A legtöbb mutációnak nincs vagy korlátozott biológiai jelentősége van, még akkor is, ha a mutáció a kódoló régióban történik, az ilyen jelentéktelen mutációs eseményeket „passenger mutációknak” nevezik. Ha egy adott tumortípusban egy génvariáns megjósolja a kezelésre adott válaszát vagy rezisztenciáját, a variánst klinikailag operálhatónak tekintik.
Onkogének és tumorszupresszor gének. A rákban gyakran mutálódó gének nagyjából két kategóriába sorolhatók: onkogének és tumorszupresszor génekre. Normál sejtekben az onkogének által kódolt fehérje főként a sejtszaporodás elősegítésében és a sejtapoptosis gátlásában játszik szerepet, míg az onkoszupresszor gének által kódolt fehérje főként a sejtosztódás negatív szabályozásáért felelős a normális sejtműködés fenntartása érdekében. A rosszindulatú transzformációs folyamatban a genomiális mutáció az onkogén aktivitás fokozódásához, valamint az onkoszupresszor gén aktivitásának csökkenéséhez vagy elvesztéséhez vezet.
Kis variáció és szerkezeti variáció. Ez a genomban előforduló két fő mutációtípus. A kis variánsok a DNS-t kis számú bázis megváltoztatásával, törlésével vagy hozzáadásával módosítják, beleértve a bázisinszerciót, deléciót, kereteltolódást, start kodonvesztést, stop kodonvesztéses mutációkat stb. A szerkezeti variáció egy nagy genomátrendeződés, amely néhány ezer bázistól a kromoszóma nagy részéig terjedő méretű génszegmenseket foglal magában, beleértve a génpéldányszám változásait, a kromoszóma delécióját, duplikációját, inverzióját vagy transzlokációját. Ezek a mutációk a fehérjefunkció csökkenését vagy fokozódását okozhatják. Az egyes gének szintjén bekövetkező változások mellett a genomiális szignatúrák a klinikai szekvenálási jelentések részét is képezik. A genomiális szignatúrák a kis és/vagy szerkezeti variációk komplex mintázataiként tekinthetők, beleértve a tumormutációs terhelést (TMB), a mikroszatellita instabilitást (MSI) és a homológ rekombinációs hibákat.

Klonális mutáció és szubklonális mutáció. A klonális mutációk minden tumorsejtben jelen vannak, jelen vannak a diagnózis felállításakor, és a kezelés előrehaladtával is jelen maradnak. Ezért a klonális mutációk potenciálisan tumorterápiás célpontként alkalmazhatók. A szubklonális mutációk csak a rákos sejtek egy részhalmazában vannak jelen, és a diagnózis kezdetén kimutathatók, de a későbbi kiújulással eltűnnek, vagy csak a kezelés után jelennek meg. A rák heterogenitása több szubklonális mutáció jelenlétére utal egyetlen rákban. Figyelemre méltó, hogy a klinikailag jelentős hajtómutációk túlnyomó többsége az összes gyakori rákfajban klonális mutáció, és a rák progressziója során stabil marad. A rezisztencia, amelyet gyakran szubklónok közvetítenek, a diagnózis felállításakor nem feltétlenül mutatható ki, de a kezelés utáni kiújuláskor jelenik meg.

A hagyományos FISH- vagy sejtkariotípus-vizsgálatot a kromoszómális szintű változások kimutatására használják. A FISH felhasználható génfúziók, deléciók és amplifikációk kimutatására, és az ilyen variánsok kimutatásának „aranystandardjának” tekintik, nagy pontossággal és érzékenységgel, de korlátozott áteresztőképességgel. Egyes hematológiai rosszindulatú daganatok, különösen az akut leukémia esetén a kariotípus-vizsgálatot továbbra is alkalmazzák a diagnózis és a prognózis irányítására, de ezt a technikát fokozatosan felváltják a célzott molekuláris vizsgálatok, mint például a FISH, a WGS és az NGS.
Az egyes gének változásai PCR-rel, valós idejű PCR-rel és digitális csepp PCR-rel is kimutathatók. Ezek a technikák nagy érzékenységűek, különösen alkalmasak kis reziduális elváltozások kimutatására és monitorozására, és viszonylag rövid idő alatt eredményt tudnak adni, hátrányuk, hogy a kimutatási tartomány korlátozott (általában csak egy vagy néhány gén mutációit észleli), és a többszörös vizsgálatok lehetősége korlátozott.
Az immunhisztokémia (IHC) egy fehérjealapú monitorozó eszköz, amelyet általában biomarkerek, például az ERBB2 (HER2) és az ösztrogénreceptorok expressziójának kimutatására használnak. Az IHC segítségével specifikus mutáns fehérjék (például BRAF V600E) és specifikus génfúziók (például ALK fúziók) is kimutathatók. Az IHC előnye, hogy könnyen integrálható a rutin szövettani elemzési folyamatba, így más vizsgálatokkal kombinálható. Ezenkívül az IHC információt nyújthat a szubcelluláris fehérjelokalizációról. Hátrányai a korlátozott skálázhatóság és a magas szervezési igények.
Második generációs szekvenálás (NGS) Az NGS nagy áteresztőképességű párhuzamos szekvenálási technikákat alkalmaz a DNS és/vagy RNS szintű variációk kimutatására. Ez a technika alkalmazható mind a teljes genom (WGS), mind az érdeklődésre számot tartó génrégiók szekvenálására. A WGS nyújtja a legátfogóbb genomiális mutációs információkat, de klinikai alkalmazásának számos akadálya van, beleértve a friss tumorszövetminták szükségességét (a WGS egyelőre nem alkalmas formalinnal immobilizált minták elemzésére) és a magas költségeket.
A célzott NGS szekvenálás magában foglalja a teljes exon szekvenálást és a célgén panelt. Ezek a tesztek DNS-próbákkal vagy PCR-amplifikációval gazdagítják az érdeklődésre számot tartó régiókat, ezáltal korlátozva a szükséges szekvenálás mennyiségét (a teljes exom a genom 1-2 százalékát teszi ki, és még az 500 gént tartalmazó nagy panelek is a genomnak csak 0,1 százalékát teszik ki). Bár a teljes exon szekvenálás jól teljesít formalin-fixált szövetekben, a költsége továbbra is magas. A célgén-kombinációk viszonylag gazdaságosak, és rugalmasságot biztosítanak a tesztelendő gének kiválasztásában. Ezenkívül a keringő szabad DNS (cfDNS) új lehetőségként jelenik meg a rákos betegek genomikai elemzésében, amelyet folyékony biopsziának neveznek. Mind a rákos sejtek, mind a normál sejtek képesek DNS-t a véráramba juttatni, és a rákos sejtekből leválasztott DNS-t keringő tumor DNS-nek (ctDNS) nevezik, amely elemezhető a tumorsejtekben lévő potenciális mutációk kimutatására.
A teszt megválasztása a kezelendő klinikai problémától függ. A jóváhagyott terápiákhoz kapcsolódó biomarkerek többsége kimutatható FISH, IHC és PCR technikákkal. Ezek a módszerek kis mennyiségű biomarker kimutatására alkalmasak, de a növekvő áteresztőképességgel nem javítják a kimutatás hatékonyságát, és ha túl sok biomarkert detektálnak, előfordulhat, hogy nem lesz elegendő szövet a kimutatáshoz. Bizonyos specifikus rákos megbetegedésekben, például a tüdőrákban, ahol nehéz szövetmintákat beszerezni, és több biomarkert kell vizsgálni, az NGS használata a jobb választás. Összefoglalva, a vizsgálat megválasztása az egyes betegeknél vizsgálandó biomarkerek számától és a biomarkerre vizsgálandó betegek számától függ. Bizonyos esetekben az IHC/FISH használata elegendő, különösen akkor, ha a célpontot azonosították, például ösztrogénreceptorok, progeszteronreceptorok és ERBB2 kimutatása emlőrákos betegeknél. Ha a genomiális mutációk átfogóbb feltárására és a potenciális terápiás célpontok keresésére van szükség, az NGS szervezettebb és költséghatékonyabb. Ezenkívül az NGS olyan esetekben is mérlegelhető, amikor az IHC/FISH eredmények kétértelműek vagy nem meggyőzőek.

Különböző irányelvek adnak útmutatást arra vonatkozóan, hogy mely betegek jogosultak genetikai tesztelésre. 2020-ban az ESMO Precíziós Orvostudományi Munkacsoportja kiadta az első NGS-vizsgálati ajánlásokat előrehaladott rákos betegek számára, javasolva a rutin NGS-vizsgálatot előrehaladott, nem laphámsejtes, nem kissejtes tüdőrák, prosztatarák, vastagbélrák, epevezeték-rák és petefészekrák tumorminták esetén, majd 2024-ben az ESMO ennek alapján frissítette az irányelveket, és az emlőrák és a ritka daganatok, például a gyomor-bélrendszeri stromális daganatok, a szarkómák, a pajzsmirigyrák és az ismeretlen eredetű daganatok bevonását javasolta.
2022-ben az ASCO áttétes vagy előrehaladott rákos betegek szomatikus genomvizsgálatáról szóló klinikai véleménye kimondja, hogy ha áttétes vagy előrehaladott szilárd tumorokban szenvedő betegeknél biomarkerrel kapcsolatos terápiát engedélyeznek, akkor ezeknél a betegeknél genetikai vizsgálat ajánlott. Például áttétes melanomában szenvedő betegeknél genomikai vizsgálatot kell végezni a BRAF V600E mutációk szűrésére, mivel a RAF és MEK inhibitorok erre az indikációra engedélyezettek. Ezenkívül genetikai vizsgálatot kell végezni akkor is, ha egyértelmű rezisztencia marker van a betegnek beadandó gyógyszerrel szemben. Az Egfrmab például hatástalan a KRAS mutáns vastagbélrákban. A beteg génszekvenálásra való alkalmasságának mérlegelésekor figyelembe kell venni a beteg fizikai állapotát, társbetegségeit és a tumor stádiumát, mivel a genomszekvenáláshoz szükséges lépések sorozata, beleértve a beteg beleegyezését, a laboratóriumi feldolgozást és a szekvenálási eredmények elemzését, megköveteli a betegtől a megfelelő fizikai kapacitást és a várható élettartamot.
A szomatikus mutációk mellett bizonyos rákos megbetegedéseket csíravonal-génekre is vizsgálni kell. A csíravonal-mutációk vizsgálata befolyásolhatja a kezelési döntéseket olyan rákos megbetegedések esetén, mint a BRCA1 és BRCA2 mutációk emlő-, petefészek-, prosztata- és hasnyálmirigyrákban. A csíravonal-mutációknak a betegek jövőbeni rákszűrésére és megelőzésére is kihatásuk lehet. Azoknak a betegeknek, akik potenciálisan alkalmasak a csíravonal-mutációk vizsgálatára, bizonyos feltételeknek kell megfelelniük, amelyek olyan tényezőket foglalnak magukban, mint a rák előfordulása a családban, a diagnózis felállításakor felállított életkor és a rák típusa. Azonban sok beteg (akár 50%-uk), aki patogén mutációkat hordoz a csíravonalban, nem felel meg a csíravonal-mutációk vizsgálatának hagyományos kritériumainak, amelyek a családi kórtörténeten alapulnak. Ezért a mutációhordozók azonosításának maximalizálása érdekében a Nemzeti Átfogó Rákhálózat (NCCN) azt javasolja, hogy az emlő-, petefészek-, endometrium-, hasnyálmirigy-, vastagbél- vagy prosztatarákban szenvedő összes vagy legtöbb beteget vizsgálják csíravonal-mutációkra.
A genetikai vizsgálatok időzítését illetően, mivel a klinikailag jelentős driver mutációk túlnyomó többsége klonális és viszonylag stabil a rák progressziója során, ésszerű genetikai vizsgálatot végezni a betegeken az előrehaladott rák diagnózisának felállításakor. A későbbi genetikai vizsgálatokhoz, különösen a molekuláris célzott terápia után, a ctDNS vizsgálat előnyösebb, mint a tumorszöveti DNS vizsgálata, mivel a vérből származó DNS tartalmazhat DNS-t az összes tumorlézióból, ami jobban elősegíti a tumor heterogenitásával kapcsolatos információk megszerzését.
A kezelés utáni ctDNS elemzése képes lehet megjósolni a tumor kezelésre adott válaszát és a betegség progresszióját korábban azonosítani, mint a standard képalkotó módszerek. Azonban még nem dolgoztak ki protokollokat ezen adatok felhasználására a kezelési döntések irányításához, és a ctDNS elemzés nem ajánlott, kivéve klinikai vizsgálatokban. A ctDNS felhasználható a radikális tumorműtét utáni kis reziduális elváltozások felmérésére is. A műtét utáni ctDNS-tesztelés a későbbi betegségprogresszió erős előrejelzője, és segíthet meghatározni, hogy a beteg profitál-e az adjuváns kemoterápiából, de a ctDNS klinikai vizsgálatokon kívüli használata az adjuváns kemoterápiás döntések irányításához továbbra sem ajánlott.

Adatfeldolgozás A genomszekvenálás első lépése a DNS kinyerése a betegmintákból, könyvtárak előkészítése és nyers szekvenálási adatok generálása. A nyers adatok további feldolgozást igényelnek, beleértve az alacsony minőségű adatok szűrését, összehasonlítását a referencia genommal, a különböző típusú mutációk azonosítását különböző analitikai algoritmusokon keresztül, ezen mutációk fehérjetranszlációra gyakorolt ​​hatásának meghatározását és a csíravonal-mutációk szűrését.
A driver gén annotáció célja a driver és az utas mutációk megkülönböztetése. A driver mutációk a tumorszupresszor gén aktivitásának elvesztéséhez vagy fokozódásához vezetnek. A tumorszupresszor gének inaktivációjához vezető kis variánsok közé tartoznak a nonszensz mutációk, a kereteltolódási mutációk és a kulcs splicing hely mutációk, valamint a ritkábban előforduló start kodon deléció, stop kodon deléció és az intron inszerciós/deléciós mutációk széles skálája. Ezenkívül a misszensz mutációk és a kis intron inszerciós/deléciós mutációk szintén a tumorszupresszor gén aktivitásának elvesztéséhez vezethetnek, ha fontos funkcionális doméneket érintenek. A tumorszupresszor gén aktivitásának elvesztéséhez vezető szerkezeti variánsok közé tartozik a részleges vagy teljes géndeléció és más genomiális variánsok, amelyek a gén leolvasási keretének pusztulásához vezetnek. Az onkogén fokozott funkciójához vezető kis variánsok közé tartoznak a misszensz mutációk és az alkalmankénti intron inszerciók/deléciók, amelyek fontos fehérjefunkcionális doméneket céloznak meg. Ritka esetekben a fehérje csonkítása vagy a splicing hely mutációi az onkogének aktiválódásához vezethetnek. Az onkogén aktiválódásához vezető szerkezeti variációk közé tartozik a génfúzió, a géndeléció és a génduplikáció.
A genomiális variáció klinikai értelmezése az azonosított mutációk klinikai jelentőségét, azaz potenciális diagnosztikai, prognosztikai vagy terápiás értékét méri fel. Számos bizonyítékokon alapuló osztályozási rendszer létezik, amelyek a genomiális variáció klinikai értelmezésének irányításához használhatók.
A Memorial Sloan-Kettering Rákközpont Precíziós Medicina Onkológiai Adatbázisa (OncoKB) négy szintre sorolja a génvariánsokat a gyógyszerhasználatra vonatkozó prediktív értékük alapján: 1/2. szint, FDA által jóváhagyott vagy klinikailag standard biomarkerek, amelyek egy adott indikáció jóváhagyott gyógyszerre adott válaszát előrejelzik; 3. szint, FDA által jóváhagyott vagy nem jóváhagyott biomarkerek, amelyek a klinikai vizsgálatokban ígéretesnek bizonyult új, célzott gyógyszerekre adott válaszra előrejelzik, és 4. szint, FDA által nem jóváhagyott biomarkerek, amelyek a klinikai vizsgálatokban meggyőző biológiai bizonyítékokat mutató új, célzott gyógyszerekre adott válaszra előrejelzik. Egy ötödik alcsoportot is hozzáadtak, amely a kezelésrezisztenciával kapcsolatos.
Az Amerikai Molekuláris Patológiai Társaság (AMP)/Amerikai Klinikai Onkológiai Társaság (ASCO)/Amerikai Patológusok Kollégiuma (CAP) szomatikus variációk értelmezésére vonatkozó irányelvei négy kategóriába sorolják a szomatikus variációkat: I. fokozat, erős klinikai jelentőséggel; II. fokozat, potenciális klinikai jelentőséggel; III. fokozat, ismeretlen klinikai jelentőségű; IV. fokozat, klinikai jelentősége nem ismert. Csak az I. és II. fokozatú variánsok értékesek a kezelési döntések szempontjából.
Az ESMO Molekuláris Célpont Klinikai Operabilitási Skálája (ESCAT) hat szintre sorolja a génvariánsokat: I. szint, rutinszerű használatra alkalmas célpontok; II. fázis, egy még tanulmányozott célpont, valószínűleg a célzott gyógyszerből profitálható betegpopuláció szűrésére szolgál, de további adatokra van szükség ennek alátámasztásához. III. fokozat, célzott génvariánsok, amelyek klinikai előnyöket mutattak más rákfajokban; IV. fokozat, csak preklinikai bizonyítékokkal alátámasztott célzott génvariánsok; V. fokozat, bizonyítékok támasztják alá a mutáció célzásának klinikai jelentőségét, de a célpont elleni egyszeri gyógyszeres terápia nem hosszabbítja meg a túlélést, vagy kombinált kezelési stratégia alkalmazható; X. fokozat, klinikai érték hiánya.